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目前主流的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）方法分為染料法和探針?lè)?，染料法以SYBRGreen法為代表，SYBRGreen染料游離時(shí)熒光微弱，但但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關(guān)系，因此熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)步驟可以通過(guò)檢測(cè)熒光計(jì)算反應(yīng)管中產(chǎn)生的雙鏈DNA（PCR產(chǎn)物）的量，但該方法沒(méi)有特異性，非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物也會(huì)被計(jì)入。
對(duì)于探針?lè)▉?lái)說(shuō)，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度也是檢測(cè)PCR產(chǎn)物量的依據(jù)。但其發(fā)光機(jī)制卻與染料法全不同。
一、熒光
是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光。
其原理為：光照射到某些原子時(shí)，光的能量使原子核周?chē)囊恍╇娮佑稍瓉?lái)的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態(tài)躍遷到第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等。第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等是不穩(wěn)定的，所以會(huì)恢復(fù)基態(tài)，當(dāng)電子由第一激發(fā)單線態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，能量會(huì)以光的形式釋放，所以產(chǎn)生熒光。
（紫外驗(yàn)鈔的原理就是利用了經(jīng)漂白處理后的紙張?jiān)谧贤饩€(波長(zhǎng)為365nm的藍(lán)光)的照射下會(huì)衍射出波長(zhǎng)為420460nm的藍(lán)光
二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)
熒光物質(zhì)間存在一種現(xiàn)象，如果一個(gè)熒光基團(tuán)（稱(chēng)為供體Donor）的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)（受體Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)二者的距離接近到一定程度（1-10nm）供體被激發(fā)光激發(fā)但是卻不發(fā)出該物質(zhì)的發(fā)射光，而是將能量轉(zhuǎn)移至受體，整個(gè)能量轉(zhuǎn)移的過(guò)程中由一對(duì)偶極子介導(dǎo)，不涉及光子的發(fā)射和重新吸收。如果受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生能量轉(zhuǎn)移熒光熄滅（即供體熒光被受體淬滅）；如果受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現(xiàn)出受體的熒光，并造成次級(jí)熒光光譜的紅移。
三、qPCR探針?lè)ǖ谋举|(zhì)
目前所有的探針?lè)╭PCR的理論基礎(chǔ)都是利用了熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，探針上存在一對(duì)能產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基團(tuán)，利用PCR反應(yīng)中的一些過(guò)程（酶切，雜交等），使兩個(gè)基團(tuán)的距離產(chǎn)生變化，使系統(tǒng)中的熒光強(qiáng)度或者熒光種類(lèi)發(fā)生變化，這種變化又與PCR產(chǎn)物的種類(lèi)和量有直接關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)這種變化，我們就可以檢測(cè)出PCR反應(yīng)體系中產(chǎn)物的種類(lèi)和量。
四、幾種qPCR探針?lè)?/strong>
1、Taq-Man探針：Taq-Man探針?lè)ㄊ墙?jīng)典的探針?lè)椒?，設(shè)計(jì)一條與擴(kuò)增產(chǎn)物能互補(bǔ)雜交的探針，在探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)（供體），在探針3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)（受體），當(dāng)探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離很近（探針長(zhǎng)度）因熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光基團(tuán)在入射光激發(fā)下不發(fā)出熒光。PCR反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針雜交在擴(kuò)增產(chǎn)物上，當(dāng)引物介導(dǎo)的延伸反應(yīng)到達(dá)探針位置時(shí)，因taq酶擁有5’-3’的外切酶活性，會(huì)從5‘端切割（水解）探針，從而使5’端的熒光基團(tuán)和3’端的淬滅基團(tuán)分離，使它們的間距超過(guò)10nm，超出熒光共振能量轉(zhuǎn)移的范圍，熒光基團(tuán)此時(shí)在合適入射光的作用下，就能發(fā)出自身波長(zhǎng)的熒光。探針雜交是特異性的，所以熒光的種類(lèi)和量能特異性的代表目標(biāo)產(chǎn)物的種類(lèi)和量。
近年來(lái)對(duì)Taq-Man探針進(jìn)行改良發(fā)展出TaqMan-MGB探針，在Taq-Man探針的3端加入一個(gè)能插入DNA小溝的二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽（DPI3），可以使大大提高探針的TM值，增加雜交反應(yīng)的特異性。
2、雙雜交探針（dualhybridizationprobe）：與Taq-Man法不同，雙雜交探針的供體基團(tuán)和受體基團(tuán)分別在兩條探針上，這兩條探針都可以與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，雜交位置不同但很接近，反應(yīng)時(shí)兩條探針一頭一尾雜交于擴(kuò)增產(chǎn)物上，雜交后兩個(gè)基團(tuán)距離在10nm以?xún)?nèi)（一般1-5堿基），此時(shí)產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，激發(fā)光下供體基團(tuán)不發(fā)光，受體基團(tuán)發(fā)光，檢測(cè)受體基團(tuán)的發(fā)光情況既可以確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的情況。
3、分子信標(biāo)探針（molecularbeacon，MB）：分子信標(biāo)探針采用的是在反應(yīng)中增加熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離的方法，和Taq-Man法不同，分子信標(biāo)探針不是采用酶切的方式使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，而是通過(guò)雜交的方式改變探針二級(jí)結(jié)構(gòu)，增加兩個(gè)基團(tuán)的距離從而使熒光基團(tuán)發(fā)光。
分子信標(biāo)探針在與靶序列雜交前呈現(xiàn)一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中環(huán)部分為能與靶序列互補(bǔ)雜交的特異性序列，臂部分互補(bǔ)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別在兩臂的末端，當(dāng)分子信標(biāo)探針呈莖環(huán)狀態(tài)時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離極近，熒光基團(tuán)被淬滅。
當(dāng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生靶序列產(chǎn)物，探針環(huán)部分與靶序列發(fā)生雜交，兩臂距離因此拉開(kāi)，兩個(gè)基團(tuán)間的距離不能形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光基團(tuán)發(fā)光。
4、蝎形探針（scorpion）：蝎形探針又叫蝎形引物，因形狀類(lèi)似蝎子而得名，其基本原理與分子信標(biāo)探針十分類(lèi)似，不同點(diǎn)在于，蝎形探針3’端帶了PCR引物，反應(yīng)中得到的產(chǎn)物與蝎形探針為一個(gè)分子，探針的雜交在分子內(nèi)部，而不需要兩個(gè)分子參與，從而使雜交反應(yīng)更加迅速，高效。
