及時(shí)解決染料法PCR試劑盒問(wèn)題是保障實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵
點(diǎn)擊次數(shù)：103 更新時(shí)間：2025-12-22
染料法PCR試劑盒憑借操作簡(jiǎn)便、成本低廉、通量靈活等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于病原檢測(cè)、基因表達(dá)分析及食品安全等領(lǐng)域。在實(shí)際使用中，可能會(huì)因引物設(shè)計(jì)不當(dāng)、模板質(zhì)量差或操作誤差，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增、無(wú)擴(kuò)增信號(hào)、熔解曲線異常等問(wèn)題，嚴(yán)重影響結(jié)果可靠性。掌握
染料法PCR試劑盒典型問(wèn)題的成因與科學(xué)解決方法，是保障實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。
一、無(wú)擴(kuò)增曲線或Ct值過(guò)高（>35）
主要原因：
模板降解或濃度過(guò)低；
引物失效或設(shè)計(jì)不合理（如Tm值不匹配、形成二聚體）；
反應(yīng)體系抑制物殘留（如酚、乙醇、肝素）。
解決方法：
重新提取高質(zhì)量RNA/DNA，用Nanodrop或Qubit定量，確保A260/A280≈1.8–2.0；
使用Primer-BLAST驗(yàn)證引物特異性，優(yōu)化退火溫度（梯度PCR測(cè)試）；
稀釋模板（1:5–1:10）以降低抑制物濃度，或純化后再用。
二、熔解曲線出現(xiàn)多峰或?qū)挿?/div>
表明存在非特異產(chǎn)物或引物二聚體：
退火溫度過(guò)低；
引物濃度過(guò)高（>500nM）；
Mg濃度過(guò)高。
應(yīng)對(duì)措施：
提高退火溫度2–5℃；
將引物終濃度調(diào)整至200–300nM；
使用試劑盒推薦的Mg濃度，避免自行添加。
三、重復(fù)性差（技術(shù)重復(fù)Ct值偏差>0.5）
加樣誤差（尤其小體積反應(yīng)）；
模板未混勻；
孔間溫度不均（儀器校準(zhǔn)缺失）。
優(yōu)化方案：
使用低吸附槍頭，采用MasterMix統(tǒng)一配制反應(yīng)液，減少移液步驟；
模板充分渦旋混勻后離心；
定期校準(zhǔn)qPCR儀溫控模塊，確保孔間一致性。
四、陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增（假陽(yáng)性）
試劑污染（如引物、水、酶被模板污染）；
氣溶膠交叉污染。
處理建議：
分區(qū)操作：試劑配制、模板加樣、擴(kuò)增分析嚴(yán)格物理隔離；
使用帶濾芯槍頭，每次實(shí)驗(yàn)更換手套；
陰性對(duì)照必須包含“無(wú)模板對(duì)照”（NTC），若NTC擴(kuò)增，整批數(shù)據(jù)作廢。
